胶内酶解

发布者:孙越作者:发布时间:2022-09-06浏览次数:10

银染样品

无尘纸擦拭实验台,保持试验台干净。弃去上清的过程中tube开口对着外部,枪头不要碰到胶,样品之间不做对比,可以不换枪头。

1. 洗胶。1mL 脱色液:50%ACN-NH4HCO350mM)震荡5min(震荡速度适中,800rpm),弃上清,再次加入上述溶液清洗3次。

2. 弃去上清1mL H2O震荡10-15分钟(震荡速度降低,500rpm),使胶溶胀。水洗的同时配脱色液:100mM 铁氰化钾/30mM硫代硫酸钠。每个样品大约各加100微升。

配制方法:硫代硫酸钠:24.8mg+1mL H2O,铁氰化钾:10mg+1mL H2O

3. 脱色。弃去上清,溶液尽量吸干净。向每个样品加入硫代硫酸钠和铁氰化钾各100微升(根据胶体积自行调整),溶液应没过胶的体积。震荡脱色2-3min至胶与溶液颜色相同(此时胶呈现黄色)。

4. 弃去上清,溶液吸干净。1mL H2O震荡10-15 min两次至胶无色。

5. 切胶。准备同样数量的空tube,各加100微升脱色液,与原始样品标注相同。按照由浅至深的顺序切胶,每次切胶后清洗玻璃板和刀片、镊子。切胶时首先将玻璃板用水-甲醇-水由内到外擦干净,分别用水和甲醇洗涤刀片。切成1mm3大小后,用镊子将刀片上的以及切好的胶全部转移至新的tube中。

6. 脱水。加入200uL 乙腈涡旋,使胶充分缩水变白(两次,根据胶状态判断)。

7. 断二硫键。弃去乙腈,将溶液吸干净,在通风橱中开盖晾5分钟。加入DTT溶液100微升左右(根据胶体积判断,没过胶),终浓度25mM50度金属浴30min

8. 保护断键位点。样品冷至室温后弃去上清,将溶液吸干净。加入IAA溶液100微升(根据胶体积判断,没过胶),终浓度为50mM。锡箔纸包好抽屉反应30min-1h

9. 脱色液Wash2次,震荡吸弃。

10.  脱水。加200uL左右ACN脱水2次至胶完全干燥(根据胶状态判断),在通风橱中开盖晾5分钟。

11.  加酶。酶的母液浓度为5ug/uL。加入酶溶液终浓度为10ng/uL。每个样品加30ul(按胶的大小),冰上孵育5-10分钟后进一步看溶液体积是否合适。枪头尽量靠近胶,但不要碰到胶,加完后如果有干胶,再加酶入溶液,最后补加碳酸氢铵至溶液没过胶。加完酶后样品要放在冰上,快速涡旋和离心,防止酶解。室温酶解过夜或37摄氏度4-6小时。

12.  提取。准备准备同样数量的空tube,标注相同,带星号区分,收集管提前放到冰上预冷。酶解样品开盖前先离心,之后的步骤开盖之前都要离心。50%ACN-H2O+1%TFA(一倍于总体积)终止酶解,震荡10-15min,吸取上清加入到新的管子中;50%ACN +0.1%TFA Buffer(体积为胶体积的2-3倍)吸取上清加入到新的管子中,10-15min70%ACN+0.1%TFA(体积为胶体积的2-3倍)吸取上清加入到新的管子中,10-15min90%ACN+0.1%TFA(体积为胶体积的2-3倍)吸取上清加入到新的管子中,10-15min;此时看胶的状态,如果已经非常干燥就可以终止,如果胶仍未干燥完全则进一步加入100%ACN一倍胶体积完全挤出溶液。

13.  冻干,-80度保存。


考染样品

无尘纸擦拭实验台,保持试验台干净。弃去上清的过程中tube开口对着外部,枪头不要碰到胶,样品之间不做对比,可以不换枪头。

1. 切胶。准备同样数量的空tube,各加200微升脱色液,与原始样品标注相同。按照由浅至深的顺序切胶,每次切胶后清洗玻璃板和刀片、镊子。切胶时首先将玻璃板用水-甲醇-水由内到外擦干净,分别用水和甲醇洗涤刀片。切成1mm3大小后,用镊子将刀片上的以及切好的胶全部转移至新的tube中。

2. 脱色。1mL 脱色液:50%ACN-NH4HCO350mM)震荡10min(震荡速度适中,800rpm),弃上清,再次加入上述溶液清洗3次直到完全脱到无色。

3. 脱水。加入200uL 乙腈涡旋,使胶充分缩水变白(根据胶状态判断)。

4. 断二硫键。弃去乙腈,将溶液吸干净,在通风橱中开盖晾5分钟。加入DTT溶液100微升左右(根据胶体积判断,没过胶),终浓度25mM50度金属浴30min

5. 保护断键位点。样品冷至室温后弃去上清,将溶液吸干净。加入IAA溶液100微升(根据胶体积判断,没过胶),终浓度为50mM。锡箔纸包好抽屉反应30min-1h

6. 脱色液Wash2次,震荡吸弃。

7. 脱水。加200uL左右ACN脱水2次至胶完全干燥(根据胶状态判断),在通风橱中开盖晾5分钟。

8. 加酶。酶的母液浓度为0.5ug/uL。加入酶溶液终浓度为10ng/uL。每个样品加30ul(按胶的大小),冰上孵育5-10分钟后进一步看溶液体积是否合适。枪头尽量靠近胶,但不要碰到胶,加完后如果有干胶,再加酶入溶液,最后补加碳酸氢铵至溶液没过胶。加完酶后样品要放在冰上,快速涡旋和离心,防止酶解。室温酶解过夜或37摄氏度4-6小时。

9. 提取。准备准备同样数量的空tube,标注相同,带星号区分,收集管提前放到冰上预冷。酶解样品开盖前先离心,之后的步骤开盖之前都要离心。50%ACN-H2O+1%TFA(一倍于总体积)终止酶解,震荡10-15min,吸取上清加入到新的管子中;50%ACN +0.1%TFA Buffer(体积为胶体积的2-3倍)吸取上清加入到新的管子中,10-15min70%ACN+0.1%TFA(体积为胶体积的2-3倍)吸取上清加入到新的管子中,10-15min90%ACN+0.1%TFA(体积为胶体积的2-3倍)吸取上清加入到新的管子中,10-15min;此时看胶的状态,如果已经非常干燥就可以终止,如果胶仍未干燥完全则进一步加入100%ACN一倍胶体积完全挤出溶液。

10. 冻干,-80度保存。


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